D-脫硫生物素應用之一

規(guī)模化分選“純凈”種子細胞的新方法

 

中國是世界人口大國，因創(chuàng)傷、疾病、遺傳、衰老等因素造成的組織和器官缺損、衰竭或功能障礙的患者人數(shù)位居世界各國，以藥物和手術(shù)治療為基本支柱的經(jīng)典醫(yī)學治療手段，已不能滿足臨床醫(yī)學的巨大需求。細胞治療可以通過移植對應組織的細胞來修復發(fā)生了病變、衰老或損傷的組織器官，從而更新其生理功能，為組織器官缺損所致的疾病提供全新的治療手段。但是，這種方法需要有足夠數(shù)量對應類型的細胞，通過常規(guī)的捐獻方法很難達到臨床上對數(shù)量和類型的要求，因而面臨著細胞來源短缺的嚴重問題，這在很大程度上阻礙了細胞治療的發(fā)展步伐。干細胞在體外培養(yǎng)條件下能夠維持自我更新，還能夠被誘導成為機體幾乎所有細胞類型，因而可以為臨床疾病的細胞治療提供重要的種子資源細胞。特別是間充質(zhì)干細胞的出現(xiàn)，其具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，因取材方便、體內(nèi)植入后不良反應較弱等優(yōu)點而備受關(guān)注，成為細胞替代治療的理想種子細胞，在細胞治療中有更廣闊的應用前景。

統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞可用于治療自身免疫病、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨骼及運動系統(tǒng)等多種疾病，且近年來間充質(zhì)干細胞用于疾病治療的案例逐年增加，并有顯著效果，因而推動間充質(zhì)干細胞臨床應用是對人類健康做出重大貢獻的舉措。除此之外，胚胎干細胞（ES）和誘導多功能干細胞（iPS）通過誘導都能夠分化成為不同類型的細胞，都是細胞治療潛在的種子細胞。但是，在誘導分化過程中由于細胞分化程度不一，因而獲得特定分化階段的細胞對臨床轉(zhuǎn)化中的療效和安全性都有重要意義。在這種情況下，如何較快獲得高質(zhì)量、足數(shù)量的目的細胞成為細胞治療亟待解決的問題。 

那么，如何解決這個問題，以推動間充質(zhì)干細胞的臨床應用呢？長期探索該問題的中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的研究團隊將這個問題分解為3個部分：細胞來源、細胞質(zhì)量以及細胞獲取方式。

在細胞來源方面，間充質(zhì)干細胞可從多種組織中獲取，但迄今為止，臍帶仍是的細胞來源。臍帶是胎兒與母體之間的紐帶，這股紐帶在分娩后通常被當做生物垃圾處理。但臍帶中蘊含著豐富的間充質(zhì)干細胞，且使用臍帶間充質(zhì)干細胞不會對母體和胎兒產(chǎn)生任何傷害。在細胞質(zhì)量方面，臍帶間充質(zhì)干細胞在臨床應用中體現(xiàn)出其他來源干細胞所不具備的*性，包括免疫原性低、副作用小等，是細胞治療的高質(zhì)量選擇。在細胞獲取方式方面，目前臍帶間充質(zhì)干細胞主要通過組織塊貼壁法獲得，但是這種方法需要花費較長的時間，而且操作過程復雜，從得到臍帶到zui終收獲細胞通常需要14~22天，妨礙了細胞治療的臨床應用。

為了促進間充質(zhì)干細胞在組織工程和細胞治療中的應用，科研工作者提出了許多新的細胞分選策略，以提高細胞的分選效率：除了目前較為流行的流式細胞術(shù)和免疫磁珠法外，還有基于細胞大小和密度的分選方法、基于沉降作用的分選方法以及發(fā)展的基于核酸識別細胞表面抗原的分選方法等，但這些方法或是分選純度不高，或是操作復雜、成本較高、對儀器依賴性強等，均不適用于大規(guī)模分選細胞。另外，流式細胞術(shù)中應用了熒光素標記抗體，分選后熒光素的存在會影響細胞的后續(xù)培養(yǎng)，而免疫磁珠法分選的細胞磁珠仍殘留在細胞上，也會造成一定的細胞毒性，雖然有些磁珠分選方法可通過酶消化zui終除去磁珠，但酶消化的同時也會破壞細胞表面抗原分子的結(jié)構(gòu)。面對細胞分選技術(shù)面臨的種種問題，研究團隊希望研制出簡單、快速、有效、無損、可逆，能夠規(guī)模化獲取間充質(zhì)干細胞并且不影響細胞的生存率和生物功能的細胞分選方法，目前已初步找到了兩種潛力的方案。 

研究團隊的*種方案利用了海藻酸和生物素-親合素系統(tǒng)（Biotin-Avidin System，BAS）。海藻酸是一種天然多聚糖，是構(gòu)成海藻的細胞壁和細胞間質(zhì)的主要成分；它屬于陰離子型共聚物，可以與金屬離子結(jié)合形成各種海藻酸鹽，具有良好的生物相容性與低毒性，而且具有很強的成膠能力，工業(yè)上將海藻酸及其衍生物產(chǎn)品統(tǒng)稱為海藻膠或褐藻膠。除海藻酸外，商業(yè)上有實用價值的海藻酸衍生物為水溶性的海藻酸鹽，包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸鈣、海藻酸銨、海藻酸丙二醇酯等，其中海藻酸鈉是制備多種海藻酸衍生物的*前體。

海藻酸鈉屬于陰離子多糖，其溶液可以與多種物質(zhì)混溶，同時也很容易與除鎂離子以外的高價陽離子、陽離子表面活性劑及強酸鍵合形成凝膠沉淀，且形成的凝膠結(jié)構(gòu)具有熱不可逆性。但通過改變pH值和加入螯合物等條件可以使凝膠解聚，瓦解凝膠結(jié)構(gòu)，改變這種不可逆性。當離子螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA）存在時，鈣離子與EDTA結(jié)合，海藻酸鈣凝膠失去鈣離子而解聚，重新形成水溶性的海藻酸。根據(jù)這一可逆過程，研究團隊制備了海藻酸修飾的磁性納米顆粒，形成了細胞無損可逆分選的基礎(chǔ)之一。

生物素-親合素系統(tǒng)是20世紀70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應放大系統(tǒng)。生物素環(huán)形結(jié)構(gòu)中的Ⅰ環(huán)為咪唑酮環(huán)（又稱Ureido環(huán)），是與親合素結(jié)合的主要部位；生物素的Ⅱ環(huán)結(jié)構(gòu)為噻吩環(huán)，帶有一個戊酸側(cè)鏈，末端羧基是標記抗體和酶的*結(jié)構(gòu)。由于生物素分子很小，因而抗體分子和酶經(jīng)生物素化后，仍能保持其原有活力不變；細胞經(jīng)生物素化后仍能保持正常的分裂、增殖能力，因此生物素常作為抗體、酶和細胞的標記。生物素-親合素系統(tǒng)的高度特異性、高度靈敏性是實現(xiàn)細胞無損可逆分選的另一基礎(chǔ)。

在基于海藻酸的自組裝和生物素-親和素系統(tǒng)的細胞分選方法中，研究團隊首先將海藻酸用鏈酶親和素標記，并將其修飾在海藻酸包裹的磁性納米顆粒上，然后對靶標分子的抗體進行生物素標記；當抗體與細胞孵育并結(jié)合到相應細胞表面標志物上后，再與鏈酶親和素修飾的磁性納米顆粒孵育，通過生物素-親和素系統(tǒng)的特性將細胞與磁性納米顆粒鏈接；zui后在磁性富集得到的目的細胞中加入EDTA，使海藻酸鈣瓦解、磁珠從細胞上釋放，即可得到不含磁珠的目的細胞（見圖1）。該步驟可使用不同抗體重復進行，直至得到目的細胞。

通過這種方法，研究團隊成功從臍帶中分離得到了臍帶間充質(zhì)干細胞，分選效率高達90%（見圖2），得到的細胞數(shù)目為每厘米150萬~200萬個，遠高于傳統(tǒng)組織塊貼壁法所得到的細胞數(shù)目（每厘米2.5萬～25萬個），且得到的細胞經(jīng)過誘導能夠分化為骨細胞和脂肪細胞

研究團隊的另一種方案利用了生物素/D-脫硫生物素與鏈霉親和素的結(jié)合能力差異，被稱為“基于生物素/D-脫硫生物素素競爭結(jié)合鏈霉親和素的細胞分選方法”。D-脫硫生物素是生物機體合成生物素的原料，是不含硫的生物素類似物，其與親和素的結(jié)合能力是生物素的十萬分之一，因而當D-脫硫生物素與親和素結(jié)合時能夠在溫和的條件下被生物素競爭取代，從而保證被分選細胞和大分子的完整性。

與生物素一樣，親和素上同樣也有4個D-脫硫生物素的結(jié)合位點，因而可利用生物素-親和素系統(tǒng)級聯(lián)放大信號的作用，將傳統(tǒng)的免疫磁珠細胞分選方法進行改良，使細胞表面的抗原放大，更易于被捕獲；此外，有些細胞表面標記物表達量較低，也可通過這種級聯(lián)放大提高捕獲效率。

該方法的實施過程為：將靶標分子的抗體用D-脫硫生物素進行標記后與細胞孵育，通過抗原-抗體結(jié)合捕獲目的細胞，將其與親和素標記的磁珠進行孵育，使細胞富集到磁珠上，磁性富集即可分離目的細胞，zui后通過與生物素孵育使細胞從磁珠上釋放，得到不含磁珠的目的細胞（見圖4）。該方法無須使用熒光素標記抗體和抗體標記磁珠，避免了熒光素和磁珠可能對細胞產(chǎn)生的細胞毒性，為細胞的后續(xù)增殖和使用提供了質(zhì)量保障。除此之外，該方法獲得的細胞不僅不含磁珠，而且細胞上的殘留物更少，在保證目的細胞表面蛋白不受破壞的前提下，為獲得“純凈”的細胞提供了新的思路。

基于臍帶間充質(zhì)干細胞在臨床應用中顯示出的其他干細胞*的*性，研究團隊對該方法的實際可行性進行了驗證，結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的免疫磁珠分選法相比，采用該方法分選得到的細胞增殖效率沒有明顯差別（見圖5）。

研究團隊綜合利用海藻酸的自組裝、生物素、D-脫硫生物素競爭結(jié)合鏈霉親和素、生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，旨在建立細胞無損可逆分選的新策略，為快速、簡便地獲得數(shù)量足夠、質(zhì)量均一的臨床級細胞提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)，推動干細胞應用的臨床轉(zhuǎn)化。綜合看來，研究團隊建立并驗證的兩種方法能夠簡便、快速地獲得目的細胞，可以滿足臨床上短期內(nèi)對特定類型細胞的大量需求，具有重要的實用價值；同時還能為基礎(chǔ)研究中獲得特定階段、特定類型的細胞提供技術(shù)支撐，節(jié)約時間和成本。因而，這兩種方法對干細胞的基礎(chǔ)研究和應用轉(zhuǎn)化均有重要的參考價值。

 

 

基于在無損、可逆分選細胞方法方面的進展和突破，研究團隊將繼續(xù)進行探索和研究，圍繞“簡單、快速地獲得不含任何外源物（包括抗體）的目的細胞”這一*目標，在后續(xù)工作中開發(fā)出更好的技術(shù)與設(shè)備，為推動干細胞的理論研究和轉(zhuǎn)化應用提供先進的