氯仿是分子量比較大的有機溶劑,在提取rna時,氯仿可以有效的使有機相和無機相迅速分離。rna提取過程,有機相中主要是酚和蛋白結合,從而使得蛋白和rna脫離,rna進入水相。氯仿的作用有多個方面,加入氯仿,雖然有變性蛋白質的作用,但是其主要用處是用來分相,實際上是加速有機相和水相的分層。一般的
RNA提取試劑TrizolReagent在4度下是油狀懸浮液,提高溫度,放置一段時間,自然也會分相。離心后混合物分成三層:下層苯酚-氯仿層,中間層,上層無色的水樣層。rna無一例外地存在于水樣層當中。水樣層的容量大約為400ul。【標準:1mltrizol加200ul的氯仿,水樣層的容量大約為所加trizol 容量的60% 】
上層水相,ph 5.1左右,當溶液ph在酸性的時候,rna分子就會沉淀在酚與溶液的界面,只有rna分子留在水相。而當ph接近中性時,rna就會溶解在水相,(導致ph中性的大概原因是trizol與樣品比例不對,應該盡量保證提取量的前提下使trizol過量)trizol法提rna,加氯仿就是要劇烈震蕩才行,這樣才能*地兩相混勻。
異丙醇的作用是通過-oh的疏水作用使得rna鏈中的親水基團受到保護,等同于沉淀,但是這是個反應時發(fā)生在水相中,與前面的氯仿不矛盾。通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀rna, rna沉淀在離心前通常不可見,形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。
異丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一樣。只不過用量少一點,0.6v——1v就夠了,在水相很多,離心管容積有限,加不下太多乙醇的時候一般會用異丙醇沉淀。不過感覺效果不如乙醇,偶爾會有沉淀不出來東西的時候。【400ul的水相對應500ul的的異丙醇。】
醇沉淀是很經常用的方法,因為rna和某些雜質不溶于異丙醇,所以可以用來沉淀。乙醇沉淀的主要目的是沉淀+除鹽。
RNA提取試劑TrizolReagent主要物質是異硫氰酸胍,它可以破壞細胞使rna釋放出來的同時,保護rna的完整性 。加入氯仿后離心,樣品分成水樣層和有機層。rna存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后,rna 可以通過異丙醇沉淀來還原。
無論是人、動物、植物還是細菌組織,trizol法對少量的組織(50-100 mg)和細胞(5×106)以及大量的組織(≥1 g)和細胞(>;107)均有較好的分離效果。RNA提取試劑TrizolReagent操作上的簡單性允許同時處理多個的樣品。所有的操作可以在一小時內完成。trizol抽提的總rna能夠避免dna和蛋白的污染。故而能夠作rna 印跡分析、斑點雜交、poly(a)+ 選擇、體外翻譯、rna酶保護分析和分子克隆。 提取時需要注意一些問題:提取時要做到超凈臺內操作、操作帶一次性手套、ep管及tip頭都要用0.1%處理(0.1%depc浸泡過夜后,高壓蒸氣滅菌)、小心、細致、晃動及每次移液要輕。這樣做的*目的就是兩個,一是小心rnase的污染降解rna;二是動作過度暴力破壞rna的完整性。
另外你提的rna做電泳的問題,一般rna電泳應該是做甲醛變性電泳,但是一般的瓊脂糖電泳也可以,需要上樣量稍微大些,并且跑電泳的時間越短越好。